© Mario Izquierdo
Las proteínas constituyen un grupo muy abundante, representando al menos el 50% en seco de la materia viva, los tipos y funciones son muy variados, existen proteínas que actúan como:
· Catalizadores en las reacciones químicas que tienen lugar en el ser vivo, como ejemplo está la peptina.
· Proteínas contráctiles que forman parte de los músculos, como es el caso de la actina y miosina, son proteínas que se encargan del transporte de materiales como la hemoglobina de la sangre.
· Proteínas que intervienen en el proceso de coagulación de la sangre, otras proteínas actúan como anticuerpos, por ejemplo la inmunoglobulina.
· Proteínas con función de reserva, como la ovoalbúmina (clara del huevo) o la caseina (leche). Se encuentran también proteínas estructurales como el colágeno, la tubulina, la elastina o la queratina.
· Proteínas reguladoras, como hormonas e insulina.
Todas las proteínas son polímeros de aminoácidos, dispuestas en secuencias lineales, contienen átomos presentes en otras moléculas orgánicas (C, N y O), y además es común que contengan átomos de nitrógeno y en otros casos de azufre, en general, son macromoléculas con un peso molecular que varía entre 6000 y un millón, todas las moléculas se componen de uno o varios polímeros no ramificados.
Aminoácido (1) :
R
+------¦---------+
¦H N - C - C - OH¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦ H O ¦
+----------------+
Los aminoácidos se unen entre sí para formar compuestos denominados polipéptidos, que se unen por enlaces peptídicos. El enlace peptídico se produce cuando el grupo carboxilo de un aminoácido reacciona con el grupo amino del siguiente, el grupo hidroxilo (-OH) del grupo carboxilo y el hidrógeno (H) del grupo amino, se separan formando una molécula de agua, y del grupo carboxilo queda un grupo carbonilo, es decir, el enlace peptídico es la unión del grupo amino de un aminoácido y el grupo carbonilo de otro.
H R O H R O
\ ¦ ¦ +--+ \ ¦ ¦
N - C - C -¦OH¦ N - C - C - OH
/ ¦ +--¦ / ¦
H H +------+ H
¦H¦
+-+
H R O H O
\ ¦ ¦ ¦ ¦
N - C - C - N - C - C - OH
/ ¦ ¦ ¦
H H H R'
El resultado es una cadena de aminoácidos, o mejor, residuos de aminoácidos, que puede estar formada hasta por 300 monómeros, en un extremo de la cadena habrá un grupo amino, denominado terminal amino o n-terminal, y en el otro extremo de la cadena un grupo carboxilo, denominado terminal carboxilo o c-terminal. A esta secuencia lineal de la cadena de aminoácidos se le denomina estructura primaria de la proteína.
El fin de la práctica es determinar la presencia o ausencia de proteínas en un preparado hecho con hígado de pollo.
Se realizarán dos reacciones:
• Reacción de Biuret:
Es una reacción que se produce con péptidos y proteínas y que no se da en los aminoácidos libres.
El tratamiento de un péptido o una proteína con CuSO4 y alcalí produce un complejo coloreado del Cu2+-péptido, que puede utilizarse cuantitativamente en un espectrofotómetro.
• Reacción Xantoproteíca:
Los aminoácidos aromáticos como por ejemplo el triptófano, la fenilalanina y la tirosina presentes en los péptidos dan una reacción característica, que es la reacción xantoproteíca. Los anillos aromáticos de estos aminoácidos se nitran fácilmente y como consecuencia aparece un color amarillo anaranjado.
• Probeta.
• Pipeta Pasteur.
• Cristalizador.
• Gradilla.
• Pipeta.
• Bureta.
• Placas Petri.
• Centrífuga (para separar las partículas por su densidad).
• Homogeneizador Potter.
• Recipiente Erlenmeyer.
• Vaso de precipitado.
• Baño termostatizado.
• Balanza.
• Obtención de un homogeneizado a partir de hígado de pollo. Reconocimiento cualitativo general de proteínas en el extracto obtenido: Reacción de Biuret. Reacción Xantoproteíca. Estudio de la actividad catalásica del extracto.
1.- Preparación del homogeneizado de pollo a partir del hígado de pollo:
- Método:
1. Troceamos 10gr. de hígado de pollo.
2. Añadimos a esos 10gr. 20ml. de tampón fosfato 0.05M, con el fin de actuar de regulador, desplazando la reacción según sea necesario y con el ello el pH.
3. Utilizamos a continuación un Potter para homogeneizar.
4. Después el homogeneizado obtenido lo repartimos en tubos de ensayo, que después introduciremos en la centrífuga, de forma que los tubos enfrentados tengan igual cantidad. Este paso tiene como fin obtener una diferenciación de partículas por densidades.
5. Recogemos el sobrenadante de los tubos de ensayo. Este sobrenadante es rico en las proteínas presentes en el hígado de pollo.
2. Reacciones realizadas con el extracto biológico:
2.A. Reacción de Biuret:
Esta reacción es general para todos los compuestos con dos uniones peptídicas y es consecuencia de la coordinación de iones cúpricos con los pares de electrones sin compartir del nitrógeno del péptido y del oxígeno del agua, con la formación de un compuesto coloreado.
- Reactivos utilizados:
• Hidróxido sódico al 20%.
• Albúmina (5mg/ml).
• Sulfato cúprico al 2.5%.
- Método:
Tomamos 5 tubos y los disponemos de la siguiente forma:
- Resultados:
En el tubo 1 se observa un cambio a color violeta, así como en el tubo nº. 3, lo que indica que existen proteínas.
2.B. Reacción Xantoproteíca:
- Reactivos utilizados:
• 2ml. de extracto problema.
• 2 ml. de ácido nítrico (20%).
• NH3 (25%).
- Método:
Pipeteamos 2ml. de extracto problema y lo depositamos en un tubo de ensayo. Después añadimos 2 ml. de nítrico al 20%. Utilizando el mechero Bunsen, calentamos con cuidado el tubo. Dejamos que se enfríe y a continuación añadimos en exceso NH3.
La disposición en los tubos de ensayo es la siguiente:
- Observación y resultados obtenidos:
En el tubo 1, que es el que contiene el extracto problema, al añadir el nítrico pasa de color marrón-rojizo a un color rosa claro. Al someterlo a mayor temperatura toma un color amarillento. Una vez frío, añadimos NH3 el color amarillento se convierte en un color amarillo mucho más fuerte, a medida que añadimos NH3, lo que indica la presencia de proteínas con aminoácidos con anillos de fenilo que dan lugar a nitrocompuestos al adicionar HNO3.
Al calentar, lo que estamos haciendo es favorecer la desnaturalización de las proteínas, es decir rompemos los enlaces. El resultado es una sustancia en el fondo que es hidrofóbica.
2.C. Observación de la presencia de catalasa:
- Fundamento:
La catalasa es una proteína con estructura tipo hemo, es decir, posee una configuración de anillos pirrólicos unidos por un metal (Fe), que actúa sobre el H2O2 descomponiéndolo en agua y O2. Esta reacción es exotérmica por tanto se desprende energía en forma de calor. Su función en algunos organismos es la de evitar la formación de peróxido de hidrógeno, cuando tiene lugar una combustión incompleta del oxígeno.
- Objetivo:
Concluir si existe o no catalasa en las diferentes muestras.
- Sustancias utilizadas:
• Extracto problema.
• Albúmina.
• H2O.
• Acido nítrico.
• Agua oxigenada.
- Resultados obtenidos:
Nota.- (+) = Existe catalasa; (-) no hay catalasa.
| Tubo | Problema (ml) |
Albúmina (5mg/ml) |
H2O ml. |
HNO3 | Q | H2O2 | Resultado |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.5 | 0.5 | + | ||||
| 2 | 0.5 | 0.5 | - | ||||
| 3 | 0.5 | 0.5 | -(P. Neg.) | ||||
| 4 | 0.5 | 4got. | 0.5 | - | |||
| 5 | 0.5 | (1) | 0.5 | - |
(1).- Sometido a 100° C durante 1 minuto.
Del resultado obtenido en el tubo número 1 se deduce que existe catalasa, ya que se desprende oxígeno y energía en forma de calor.
Por el contrario en el tubo 4, al añadirle nítrico, lo que hemos hecho es cambiar el pH haciéndolo ácido, desnaturalizándose las proteínas, y por tanto da negativo.
En el caso del tubo 5, el resultado también es negativo, por la misma razón que en el tubo 4. Las proteínas se han desnaturalizado, es decir la estructura cuaternaria o ternaria se ha roto gracias a la energía que le hemos comunicado, en este caso calorífica, cambiando la disposición espacial y con ello su función.
- Comparación de la cantidad de catalasa:
Vamos a comparar ahora la cantidad de catalasa existente en dos sustancias: una vegetal (patata) y otra en tejido animal (hígado de pollo fresco).
Se observa claramente que la reacción es mucho mayor en el trozo de hígado de pollo, que en el trozo de patata, lo que indica que existe una cantidad mayor de catalasa en el hígado de pollo que en el trozo de patata.
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